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Ki67蛋白是细胞周期相关的一种核蛋白，主要表达于细胞增殖分裂的各个时期(G1、S、G2和M期)，但是在静息的细胞(G0期)中不表达。Ki67常用于检测肿瘤细胞的生长指数(免疫组化法利用计算细胞总数中的Ki67阳性细胞数所占比例得到Ki67指数)。

Ki67通常通过标记抗Ki67的抗体(FITC绿色荧光)和DNA染料碘化丙啶(PI，红色)而利用流式细胞仪检测来实现对细胞周期的检测。

1. 仪器：微量移液器、低速离心机、平板摇床、微量移液器、流式细胞仪、1.5mL Micro-tube。
   
2. 试剂：Tween-20、Triton X-100、BSA、0.05%胰蛋白酶-EDTA细胞消化液、乙醇。
   
3. 要求用户自备的溶液及其配置：
   
   1. PBS/1% BSA洗涤液：0.1g BSA溶于10mL PBS，按实验用量配制所需要的体积量。
      
   2. 抗体孵育液0.5% Tween-20/1%BSA/PBS：0.05mL Tween-20,0.1g BSA溶于9.95mL PBS。
      
   3. PI染色母液(1mg/mL)
      
   4. RNase A

1. 所有的沉淀细胞步骤为2000rpm，5min。
   
2. 可渗透化处理细胞后细胞浓度大约为10⁶，样品可以4℃储存于乙醇中到2个星期。
   
3. 流式细胞检测时需要设立对照试验：
   ① 只用PI染细胞
   ② 只用羊抗兔IgG-FITC染细胞
   ③ 未染色的细胞组

1. 在最适的环境下培养细胞。
   
2. 除去培养液，用PBS洗一次。
   
3. 胰蛋白酶处理和收集细胞，离心，(注意1)保证每管细胞数在) 106个。
   
4. 用0.3mL PBS轻轻的重悬细胞，然后慢慢加入0.7mL预冷的100%乙醇。用1mL玻璃移液管小心的混匀。在4℃至少1h。(注意2)
   
5. 沉淀细胞，完全吸去上清。
   
6. 用150μL PBS/1% BSA洗细胞2次。
   
7. 用100μL抗体孵育液(0.5% Tween-20/1%BSA/PBS)重悬细胞，加入1μL Ki67抗体(1μg/10⁶ cells)，室温孵育1小时。
   
8. 离心收集细胞，用150μL1% BSA-PBS洗2次。
   
9. 离心收集细胞，用50μL抗体孵育液重悬，加1μL (1.5μg/10⁶ cells)羊抗兔IgG-FITC，室温孵育30分钟。离心收集细胞，150μL PBS/1% BSA洗2次。
   
10. 用含有终浓度为10μg/mL RNase A和20μg/mL PI的0.5mL PBS(pH7.4)重悬细胞。
    
11. 避光使细胞在室温下孵育20min后，离心收集细胞，150μL PBS/1% BSA洗2次后，转移至流式检测管中重悬。
    
12. FACS检测或者储存于4℃。(注意3)