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Ki67蛋白是细胞周期相关的一种核蛋白，主要表达于细胞增殖分裂的各个时期(G1、S、G2和M期)，但是在静息的细胞(G0期)中不表达。Ki67常用于检测肿瘤细胞的生长指数(免疫组化法利用计算细胞总数中的Ki67阳性细胞数所占比例得到Ki67指数)。

PBS、PI染色液、BSA、RNase A、胰蛋白酶-EDTA细胞消化液、1.5mL离心管、Tween-20、Triton X-100、去离子水、30%过氧化氢溶液、乙醇微量移液器、低速离心机、平板摇床、微量移液器、荧光显微镜、流式细胞仪

1. 本试剂盒操作步骤中，收集细胞的离心条件为2000rpm，时间为5min。
   
2. 可渗透化处理细胞后细胞浓度大约为106，样品可以4℃储存于乙醇中2个星期。
   
3. 流式细胞检测时需要设立对照试验：
   
   1. 只用PI染细胞；
      
   2. 只用羊抗兔IgG-FITC染细胞；
      
   3. 未染色的细胞组。

1. 1%BSA洗涤液：0.1mg BSA溶于10mL PBS，按实验用量配制所需要的体积量。
   
2. 抗体孵育液：0.05mL Tween-20，0.1mg BSA溶于9.95mL PBS。

1. 去除细胞培养基，使用PBS将细胞清洗1次，使用胰酶消化液消化并2000rpm离心收集细胞，保证每管细胞数在10⁶个。
   
2. 用0.3mL PBS轻轻的重悬细胞，然后慢慢加入0.7mL预冷的100%乙醇，轻轻混匀，4℃存放1h，如需保存可4℃保存2星期。
   
3. 2000rpm离心收集细胞，完全洗去上清。
   
4. 使用配制好的1% BSA溶液150μL清洗细胞2次。

1. 使用100μL抗体孵育液重悬细胞，加入1μL anti-Ki67 antibody (1μg/10⁶个细胞)，室温孵育1h。
   
2. 2000rpm离心收集细胞，用150μL 1% BSA溶液清洗2次。
   
3. 2000rpm离心收集细胞，用50μL抗体孵育液重悬，加1μL(1.5μg/10⁶个细胞)FITC-羊抗兔IgG，室温孵育30min。2000rpm离心收集细胞，使用150μL 1% BSA溶液清洗2次，2000rpm离心收集细胞。
   
4. 配制含有终浓度为10μg/mL RNase A和20μg/mL PI的PBS，吸取0.5mL加入离心管中，轻轻重悬细胞。
   
5. 室温避光孵育20min，2000rpm离心收集细胞，加入150μL 1% BSA溶液清洗2次。
   
6. 将细胞转移至流式管中重悬，即可流式检测；或放于荧光显微镜下观察。